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最新研究:寿命成功翻一番,基因编程实现逆转衰老将成现实?

衰老是人类疾病中最强的风险因素之一。“对抗衰老、延长寿命”是人们自古以来便追求的东西,神话里也不乏长生不老仙丹的传说。不过,随着科学技术的发展,人们对衰老机制的了解越来越深入,延缓甚至逆转衰老不再是天方夜谭。

但需要注意的是,增加寿命并不代表生活质量的提高或健康寿命的延长。例如,虽然一个生命体能活得更长,但仍会经历与年龄相关的疾病和生理衰退。与此相反的是,年龄逆转是指将生命体恢复到更年轻的状态,在细胞水平上消除衰老的影响,从而增加健康寿命。所以,研究应该从这两个角度出发。

近日,来自美国Rejuvenate Bio公司的研究者发表了题为“Gene Therapy Mediated Partial Reprogramming Extends Lifespan and Reverses Age-Related Changes in Aged Mice”的研究论文,研究人员在衰老的小鼠中注射了携带有三个山中(Yamanaka)因子基因的病毒。结果显示,这些小鼠平均活了18周,是对照组小鼠的2倍!更令人惊喜的是,小鼠体内的DNA甲基化模式有了一定程度的逆转。

一、研究背景

衰老是一个复杂的过程,最典型的特征是—-细胞过程的慢性失调,进而导致组织和器官功能恶化。现阶段仍没有预防衰老的方法,但针对这些细胞过程,可以通过干预措施使其恢复最佳功能,从而提升寿命和健康。

现有证据表明,山中因子的重编程,能在体外和体内逆转与年龄相关的变化。然而,山中因子(或其子集)是否能够延长衰老野生型小鼠的寿命,仍不得而知。因此,研究人员对此进行了进一步的研究。

二、研究方法

1、载体和AAV生成

通过Genscript生成了含有四环素响应元件3(TRE3)启动子的构建体,该启动子从多顺反子转录物(TRE3-OSK)驱动人OCT3/4、SOX2和KLF4的表达,同时生成了编码hEf1a启动子驱动的rtTA4(hEf1a-rtTA4)的第二个构建体。

通过SignaGen将构建体包装在AAV9衣壳中生成AAV9.TRE3-OSK-SV40pA(1.556 E13 vg/ml)和AAV9-hEf1a-rtTA4-SV40pB(1.88 E12 vg/ml)。详情如下图所示:

研究中使用的构建体、病毒和注射途径示意图

(来源:Macip, C., et al. 2023)

2、小鼠研究和虚弱评分

将年龄124周的雄性C57BL6/J小鼠注射上述两种病毒,剂量1E12 vg/只小鼠(100μl体积),通过眼眶后途径注射。对照小鼠注射100μl配方缓冲液(PBS)。研究期间在饮用水中添加多西环素,终浓度2mg/ml,进行了“一周用/一周休”的多西环素诱导。对照小鼠在饮用水中接受与载体注射小鼠相同浓度的多西环素。

对小鼠进行单独称重,并依据28个不同变量进行评估,包括身体、生理和先天反射条件(包括简单的感觉和运动测试、体温和整体身体状况评估)。将所有单项得分(不包括体温和体重)相加,计算每只小鼠的脆弱指数得分(FI)。

3、组织DNA提取和甲基化研究

实验结束时,将健康并安乐死的小鼠选入甲基化研究。按照制造商说明书,使用DNeasy血液和组织试剂盒从肝脏和心脏进行提取。随后,对上述提取的DNA进行甲基化分析。

4、慢病毒的产生与角质形成细胞的转导

将编码由人EF1ɑ启动子、PsPax2和PmD2.G驱动的多顺反子OSK的质粒与PEI和Opti-MEM(Gibco)共转染到HEK293T细胞中。第2天,用含有DMEM、15%FBS和1%PenStrep(Gibco)的收获培养基替换培养基。在第3天和第4天收集上清液,通过0.45聚醚砜膜过滤,将1倍体积的Lenti-X浓缩液与3倍体积的澄清病毒培养基合并,并在4°C下储存过夜。

将病毒培养基以1500 x g离心45分钟,将颗粒重新悬浮在DMEM中。使用Lenti-X GoStix Plus对病毒进行滴度测定。将含有慢病毒的培养基滴加到HEK001(ATCC CRL-2404)传代110中(含有8ug/ml聚胺)。在第2天加入嘌呤霉素,扩增和维持存活细胞,每3天更换一次培养基。第23天,收集细胞进行免疫印迹和甲基化分析。

5、免疫印迹分析

使用含有1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液(CST)在冰上提取上述细胞的蛋白质。将细胞裂解混合物在14,000g/4°C下旋转10分钟,收集上清液,并使用Pierce Rapid Gold BCA蛋白质测定试剂盒进行定量。

将等量的蛋白质装入4-15%聚丙烯酰胺凝胶中,并转移到PVDF膜上。将膜与一抗在4°C下孵育过夜。第二天,在室温下将膜在与HRP偶联的二抗中孵育1小时,并用ECL Prime Western印迹检测试剂进行显影。

三、研究结果

实验结果表明,在124周龄小鼠中,编码可诱导OSK系统的AAV递送比野生型对照延长了109%的中位剩余寿命,并提高了几个健康参数(如下图)。而且,研究人员观察到虚弱评分的显著改善,表明实验干预能够在延长寿命的同时,改善健康寿命。

图注:左图:注射AAV9.TRE-OSK和AAV9.hEF1ɑ-rtTA4的124周野生型小鼠的Kaplan-Meier曲线。右图:对照小鼠和TRE-OSK小鼠在整个寿命期内的总存活比例曲线(来源:Macip, C., et al. 2023)

从死亡的对照组和TRE-OSK处理的小鼠心脏和肝脏组织中分离出DNA,发现肝脏和心脏的寿命时钟(LUC)都有减少表观遗传年龄的趋势。此外,在表达外源性OSK的人角质形成细胞中,观察到年龄逆转的显著表观遗传标记,这表明遗传网络可能会被重新调节到更年轻、更健康的状态。

综上,该研究的小鼠和角质细胞数据表明,AAV介导的基因治疗递送OSK可提高小鼠的寿命,改善健康参数,并逆转人类细胞衰老的生物标志物。

四、总结

再生医学的目标是改善组织和器官功能,纠正疾病状态。通过部分重编程实现细胞再生,已被证明是实现再生医学目标的一条有前景的途径。研究证明,在人类细胞中,OSK的外源性表达导致年龄逆转。

这项研究首次证实,基于AAV的系统治疗可以使极高龄野生型C57BL6/J小鼠的剩余中位寿命延长,同时也改善健康结果。这项研究的结果,对开发部分重编程干预措施,以逆转老年人年龄相关疾病,具有重要意义。

但目前还需要进行实验来评估特定组织中的表观遗传编程特征,并对这些研究中的RNA图谱进行全面深入的分析,以便研究哪些途径被重编程为更年轻的状态。

来自梅斯学术

 

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